För att ge en så sammanhängande beskrivning som möjligt av genteknik, en gren och vidareutveckling av bioteknik, så går Vi igenom hur Vi primater isolerar en gen från en organism och klistrar in den i genomet hos en annan organism. Primaten som skrivit detta beskriver genmanipulation av bakterier, däggdjursceller, och växtceller.

Isolering av DNA

För att komma åt arvsmassan i en bakterie måste Vi luckra upp cellmembranet och därefter isolera DNA. Då gör vi som så att Vi tillför EDTA, som är en vanlig substans på kemlab för analys, och detergenter, alltså vanligt tvättmedel. EDTA skadar cellväggen och detergenterna skadar cellmembranet hos bakterien. Men, hur gör Vi med vår typ av celler, däggdjursceller? Jo, Vi skadar dem med ultraljud och Vi erhåller ett lysat, en vätska, som Vi primater (Homo sapiens) låter centrifugera. Vid centrifugeringen så skiljs cellmembrandelar och ribosomer som bildar en pellet i botten av Falconröret. Ribosomer är stora strukturer som används i grundläggande processer i cellen och som har hög vikt. Supernatanten innehåller förutom DNA även RNA och protein. Vi primater önskar dock rena upp det erhållna DNA:t, vilket Vi ordnar genom att tillsätta etanol (Spiritus fortis) och salt (koksalt, NaCl), och för att få ut rent DNA tillsätter Vi primater även fenol för att avlägsna protein. När DNA:t separerats ut, tillsätter primaterna RNAaser till DNA:t för att tvätta DNA:t rent från RNA:t. Därefter tillsätts etanol och salt (NaCl). När primaterna väl fått ut rent DNA tillsätter Vi EDTA för att hindra att eventuella DNAaser bryter ner DNA:t Vi arbetar med. Växtceller har både en stark cellvägg och cellmembran, så då fungerar inte dessa tekniker, utan det diskuterar vi längre fram i skrivelsen.

Klippa och klistra DNA

När Vi väl isolerat DNA:t vill primater som Oss även kunna klippa ut den sekvens i DNA:t Vi är intresserade av och använder då ett restriktionsnukleas eller ”restriktionsenzym”. Dessa enzymer är idag en imponerande mängd som kan klippa i DNA:t. Exempelvis kan vi klippa med enzymet EcoR1.

Vi klipper med i DNA-helixen med EcoR1 och får DNA-fragment som är fyra baspar långa. Dessa har en viss sekvens som faktiskt är komplementära. Dessa kallas sticky ends. Sedan finns en typ av nukleaser som går under namnet rare cutters, och dessa känner igen mer än sex baspar. Till dessa hör exempelvis NotI. Sedan finns en typ av restriktiosnukleaser som klipper på samma plats och dessa fragment får inte sticky ends utan blunt ends, inga klistriga ändar med andra ord.

Sortering av DNA

När Vi väl har olika fragment av DNA behöver Vi primater separera dem från varandra, vilket sker med hjälp av en teknik som heter gelelektrofores. Det är agarosgelelektrofores där DNA-fragmenten placeras i små brunnar i agarosgelen och gelen täcks med en buffert med joner. Bredvid har man en referens med känd vikt för de olika fragmenten vilket gör att man kan se tyngden. Tyngden anges i kb, Kilobaspar. DNA:t färgas sedan med etidiumbromid och med skydd för ögonen/skyddsglasögon då man behöver använda UV-ljus. Vanliga glasögon räcker. Med detta kan Vi primater se DNA-bitarna (sekvenser). Etidiumbromid lägger sig i DNA:t, den interkalerar, och sedan kan primaterna använda en steriliserad skalpell för att skära ut det DNA Vi vill åt i den aktuella studien. DNA:t extraheras ut från den aktuella biten och skalpellen läggs i hett vattenbad med hypokloritlösning.

Sammanfoga fragment av DNA

Om Vi har sticky ends med DNA så kan dessa baspara med varandra och ett enzym, som heter ligas, klistrar ihop DNA-strängarna med varandra och detta genom att klistra ihop dessa socker-fosfat-kedjor. Att stoppa in en DNA-sekvens i en bakteriecell är inte svårt alls, den fortplantas även. Men, hur ska de nya DNA-cellerna kunna särskiljas från de celler som inte har sekvensen. Jo, Vi tillför inte sekvensen, eller genen, helt ensam utan har med en gen som kodar för resistens mot en antibiotika. Sedan tillför Vi antibiotika och då kommer endast de bakterier som har gen för antibiotikaresistens och genen primaterna är intresserad av att överleva. På det sättet kan Vi mångfaldiga genen av intresse, eller mer formellt klona den. Då en gen inte kan klara sig i fri form i en cell så måste denna infogas i en bärare som kallas vektor och då väljer man ett litet cirkulärt DNA benämnd plasmid. Då många bakterier bär på plasmider så är det något primaterna på lab gärna använder. Den besitter nämligen både replikationsorigin och utrymme för en DNA-sekvens på tusentals baspar. Genom att odla dessa bakterier i rör, exempelvis Falconrör, med plasmider och tillföra antibiotika så överlever endast de transformerade bakterierna. När vi därefter odlar dessa bakterier så erhålls en stor mängd av DNA:t i fråga.

Låt säga att primaterna önskar isolera en viss gen men inte vet sekvensen. Därför skapar Vi då ett genbibliotek. Då Vi vill få en gen från en bakterie, ja då isolerar Vi DNA från den bakterien genom att klippa med restriktionsnukleaser och erhåller ett antal fragment med sticky ends. Vi kombinerar sedan dem med uppklippta plasmider där Vi använt samma restriktionsnukleas, till exempel HindIII, och slutligen tillförs ligas för att sammanfoga socker-fosfat-skelettet som är själva ryggraden i DNA. Basparingen sker automatiskt, och då primaterna sedan transformerar låt säga tarmbakterien E coli, så ger dessa ett stort antal plasmider med delar av den ursprungliga bakteriens genom. Därmed öppnar primaterna ett par flaskor mousserande vin och firar framgången. Sedan återstår att finna den gen Vi är ute efter genom screening.

Screening medelst oligonukleotider

I denna teknik används en DNA-sekvens/liten bit DNA som passar ihop med genen primaterna är intresserade av. Vi utgår ifrån det protein genen kodar för och motsvarande oligonukleotid/sekvens av DNA. Då DNA har olika synonymer för en mindre uppsättning alternativa DNA-”prober” / DNA-sonder så får primaterna gissa lite kring den exakta sekvensen. DNA-sonderna framställs i maskiner och märks med radioaktivitet. Sedan letas de kolonier upp som har den gen Vi primater önskar undersöka.

Hos eukaryota celler, som hos primaterna och de andra djuren, så gäller att eukaryota celler är betydligt större och det mesta DNA:t är inte kodande för proteiner. Det vore ett fullkomligt omöjligt antal bakteriekloner som skulle krävas för att finna genen.

Copy-DNA, cDNA

När Vi skall isolera eukaryoternas anlag använder Vi primater Oss av en annan typ av genbibliotek som kallas copy-DNA eller ”cDNA” och det fungerar alldeles utmärkt. Detta cDNA genereras från mRNA (messenger ribonukleic acid), och på detta sätt får primaterna fram cDNA med eukaryota gener. Vill Vi primater komma åt en gen som uttrycks mest i leverceller (hepatocyter), ja då isolerar Vi ut mRNA från leverceller (hepatocyter, av grekiskans hepas = lever) och behadlar detta mRNA med ett enzym som heter reverse transcriptase och får därmed cDNA med genen som enbart uttrycks i leverceller. Det erhållna cDNA vilket erhålles stoppas in i lämplig vektor. Därmed erhålles ett cDNA-bibliotek där ett stort antal kloner bär på relevant DNA. Då eukaryota gener har introner och icke-kodande DNA så sparar Vi primater en massa av vår värdefulla tid, storlek, och resurser genom att använda copy-DNA / cDNA, ca 15,000 baspar extra DNA som därmed skalas ner till kodande DNA på ca 5,000 baspar. Därmed skalas cDNA-biblioteket till en storlek som är lämplig för en vektor.
Manipulation av däggdjursceller

Det är lätt att föra in alternerat DNA i däggdjursceller, men desto svårare att få DNA:t att förbli kvar i dessa celler. Primaterna använder då gener som ger defekter i metabolismen så att ett speciellt näringsmedium krävs för att dessa celler skall överleva. Endast genom att i plasmider som bär på en gen, eller flera, som kompenserar för defekten i ämnesomsättningen/metabolismen kan en selektion genomföras.

Manipulation av växter

Det är mycket svårt att framgångsrikt få fram en transmuterad växt. Dels på grund av en riktigt stark cellvägg och dels för att växter är flercelliga. Men genom årmiljonerna har det funnits en bakterie som redan gjort detta arbete åt primaterna. Denna bakterie heter Agrobakterien (Agrobacterium tumefaciens) och denna bakteries celler har en speciell plasmid som går under namnet Ti-plasmid bortsett från sitt kromatin, med bakteriens egen arvsmassa. I Ti-plasmiden finns T-DNA som den kan överföra till växtceller, och en del gener som programmerar för de proteiner som gör transmutationen möjlig. När Vi väl låter en agrobakterie möta en växtcell med skadad cellvägg så överförs T-DNA:t till växtcellen från själva Ti-plasmiden. I det omtalade T-DNA:t ingår genen som tillverkar näringsämnen som växtcellen inte nyttjar, utan snarare för att agrobakterien skall överleva (vilket evolutionen går ut på, överlevnad) och dels finns det gener som gör att delar sig ohämmat så att det bildas en klump av celler med konturer av cancerceller.

De små primaterna har gjort förändringar i tekniken. Vi har avlägsnat den uppsättning anlag som sitter i T-DNA:t och fört in nya gener. Dock är Ti-plasmiden stor och otymplig så det har kemister och molekylärbiologer löst. Vi har helt enkelt spaltat upp Ti-plasmiden i två mindre: 1. en plasmid med relevant T-DNA och 2. en plasmid med de gener som krävs för att T-DNA:t skall kunna överföras. Vidare har T-DNA:t gravt manipulerats så att det idag går att använda E coli. Genom en teknik som heter konjugering går det att ”transplantera” den färdiga plasmiden till Agrobakterien. Skär primaterna sedan ett växtblad i strimlor så kommer bakterien i fråga att transferera sitt T-DNA till växtcellerna i ytan där dessa primater skurit i den. Då växtcellerna inte är så olika från varandra som i däggdjursceller så kan primaterna få fram nya blad med en typ av hormoner med rötter och medelst andra typer av hormon-cocktails. Sedan kan Vi låta växtbiten växa till sig och Vi får så småningom en ny planta. Denna typ av celler, callacusceller, och det är när växtceller differentierar tillbaka som primaterna tar tillfället i akt.

Vill Vi föra in nya gener i en växt så stoppar Vi in genen i T-DNA tillsammans med en gen som gör växtcellen resistent mot pesticider. Plasmiden med genen Vi är intresserade av inkorporerar Vi till den nu bekanta agrobakterien och smetar ut detta på en näringsplatta med pesticiden ifråga som den framtagna plasmiden ger resistens emot. Sedan tar Vi fram växten, tar ett blad och skär ånyo i strimlor och lägger ut dessa strimlor över plattan. Efter ett par dagar formas vita callusklumpar i miniatyr, från de växtceller som erhållit T-DNA:t och är alltså resistenta mot pesticiderna i näringsplattan. Callacusklumparna överförs till en ny näringsplatta och Vi tillsätter en hormoncocktail och det bildas skott på callacusklumparna och det bildas även blad. Primaterna placerar detta på en ny näringsplatta och Vi har även tillfört hormoner för att stimulera rotbildning. Rötterna benämns auxiner och efter en till vecka har primaterna erhållit en genmanipulerad planta som är pytteliten, innehållandes den inlagda genen. Sedan är det bara att plantera denna planta i en kruka och vattna. Denna metod lämpar sig för tvåhjärtbladiga växter, till exempel tobak, tomat, och potatis. Däremot kunde primaterna inte genmanipulera enhjärtsbladiga växter såsom ris och vete då litteraturen skrevs som denna primat utgår ifrån. Då användes, i brist på ny teknik, en liten kanon med kulor laddad med kulor av tungsten med nytt DNA på växten ifråga. Det passerar då genom en växtcell, minst en, och DNA:t hamnar i cellens arvsmassa. Idag har primaterna dock agrobakterier som kan transformera enhjärtsbladiga växter.